Western Blot 實驗應該注意什么？
來源：本站 作者：jiyuanbio 時間：2025/2/19
Western Blot 實驗是什么？
Western Blot 實驗，又叫蛋白質免疫印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法，在蛋白質分析領域占據(jù)著舉足輕重的地位 。它就像是蛋白質世界里的 “超級偵探”，能夠從復雜的蛋白質混合物中精準地找出目標蛋白。
在科研的眾多領域，比如生物醫(yī)學研究中，科學家們想要了解某種疾病相關的蛋白質變化，或者在藥物研發(fā)中，探究藥物對蛋白質表達的影響，Western Blot 實驗都能大顯身手。它主要有兩大關鍵作用，一是定性分析，判斷目標蛋白是否存在；二是半定量分析，比較不同樣本中目標蛋白表達量的相對高低 。比如在研究腫瘤細胞和正常細胞的差異時，通過 Western Blot 實驗，就能知道某些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的蛋白質在兩種細胞中的表達情況，是腫瘤細胞中表達量升高，還是正常細胞中表達量更高，從而為腫瘤的診斷和治療提供重要線索。
樣本制備：實驗的基石
樣本制備是 Western Blot 實驗的開篇之作，其重要性如同基石之于高樓。這一步驟的成功與否，直接關系到后續(xù)實驗能否順利進行。只有制備出高質量的樣本，才能為后續(xù)的蛋白質分析提供可靠的基礎。
在樣本制備過程中，裂解液的選擇是首要關鍵。不同的蛋白質定位需要不同的裂解液，就像不同的鎖需要不同的鑰匙。比如，對于全細胞蛋白的提取，NP-40、Triton X-100 或 RIPA 裂解液較為常用；而細胞質（可溶）蛋白，Tris-HCl 裂解液更為合適 。一旦樣品開始裂解，蛋白降解、去磷酸化和變性也隨即開始，所以樣本裂解過程中要全程保持低溫（冰上或 4℃），所使用的試劑和耗材要提前預冷，并且裂解前幾分鐘要向裂解緩沖液中加入合適的酶抑制劑來減緩這些反應。
樣本制備還有諸多注意事項。裂解液緩沖液 pH 值要合適，一般采用接近生理 pH 的緩沖液，如 Tris-HCl、PBS 等，pH 值太低或太高都有可能引起蛋白的變性、析出。蛋白提取時盡量保證不同樣品的鹽濃度一致，鹽離子濃度不一致會導致蛋白條帶寬窄不一；同時裂解液的鹽離子濃度不能太高，一般采用接近生理狀態(tài)的鹽離子濃度，防止蛋白鹽析；樣本鹽濃度比較高還會導致蛋白往兩邊擴散，使得條帶越來越寬，最后條帶連在一起；也可能會導致泳道內部電流偏大，最后出現(xiàn)笑臉的條帶。根據(jù)目的蛋白定位選擇合適的去垢劑裂解液，常見的去垢劑有 Triton X-100、NP40、SDS 等，不同的裂解液提取強度不同，其中 SDS 及其他離子型去垢劑的裂解液溶解能力最強，最有可能獲得最高的得率，但是會破壞蛋白 - 蛋白之間的相互作用，不適合 Co-IP 或者 Pull down 這類實驗，如果想盡量保護蛋白 - 蛋白相互作用，避免蛋白變性，需要選擇溫和的非離子型去垢劑（例如 Triton X-100），或者直接用 Tris-HCl，PBS 這類不含去垢劑的緩沖液借助物理破碎提取可溶蛋白 。提取的樣本要盡可能新鮮，裂解前幾分鐘加相應的酶抑制劑，提取時間要充足，提取全過程要保持低溫操作，使用的試劑和耗材要提前遇冷，提取后的樣本保存過程中要避免多次反復凍融。
凝膠制備：打造優(yōu)質分離平臺
凝膠制備是 Western Blot 實驗中至關重要的一環(huán)，它直接關乎到蛋白質的分離效果，就如同搭建舞臺，只有舞臺搭建得穩(wěn)固、合適，后續(xù)的 “表演”（蛋白質分離與檢測）才能精彩呈現(xiàn)。
在制備凝膠時，均一膠的制備尤為關鍵。要確保凝膠濃度均勻一致，這需要在配制過程中充分攪拌各種試劑，讓它們完美融合。不同濃度的凝膠適用于不同分子量范圍的蛋白質。低濃度的凝膠（如 5%），就像寬敞的大道，更適合大分子量的蛋白質（大于 200 kDa）在其中遷移；中等濃度的凝膠（10%-12%）則像是城市里的主干道，通常用于分離中等分子量范圍的蛋白質（25-200 kDa）；而高濃度的凝膠（15% 或更高）如同狹窄的小巷，適合分離小分子量的蛋白質（小于 25 kDa） 。比如，當我們研究的目標蛋白是分子量較大的膠原蛋白時，就需要選擇低濃度的凝膠，讓它能夠在凝膠中順利遷移，與其他雜質蛋白分離開來。
在制膠過程中，AP（過硫酸銨）和 TEMED（四甲基乙二胺）的用量控制是一個要點。AP 是引發(fā)劑，TEMED 是加速劑，它們共同作用促使丙烯酰胺聚合形成凝膠。用量過多，凝膠會迅速聚合，可能導致凝膠不均勻，還會產(chǎn)生過多的自由基，對蛋白質造成損傷；用量過少，聚合速度過慢，甚至可能無法聚合。聚合時間的把控也不容忽視。聚合時間過短，凝膠未完全凝固，在后續(xù)電泳過程中容易變形，影響蛋白分離效果；聚合時間過長，凝膠會變脆，同樣不利于實驗進行。一般來說，在室溫下，凝膠的聚合時間在 30 分鐘到 1 小時左右，不過具體時間還需根據(jù)實際情況進行調整。制膠時要隔絕氧氣，因為氧氣會抑制凝膠的聚合，所以在灌膠后，通常會在膠液表面覆蓋一層水或異丙醇，形成一個無氧的環(huán)境，助力凝膠順利聚合。
電泳：蛋白分離的關鍵環(huán)節(jié)
電泳是 Western Blot 實驗中分離蛋白的關鍵環(huán)節(jié)，它就像是一場精彩的賽跑，不同分子量的蛋白質在電場的驅動下，在凝膠這個 “跑道” 上展開激烈角逐，從而實現(xiàn)分離。
在進行上樣與電泳時，諸多要點需要牢記。為了實時觀察電泳進程，判斷蛋白分子量大小，同時檢驗轉膜效果，使用預染蛋白 Marker 是個不錯的選擇。比如，在研究某種未知蛋白質時，通過預染蛋白 Marker，就能直觀地看到不同分子量的標準蛋白在凝膠中的遷移位置，從而推測出未知蛋白的分子量范圍 。
上樣時，要盡量保證每個泳道的蛋白量一致，體積也盡量相同。這就好比給每個參賽選手提供相同的裝備和資源，讓比賽更加公平。如果蛋白量差異過大，就像有的選手負重過多，有的選手則輕裝上陣，會導致條帶的亮度和寬度出現(xiàn)明顯差異，影響后續(xù)的分析判斷。一般來說，對于全細胞裂解液，上樣量在 20 - 50 μg 較為合適；對于純化的蛋白，上樣量可以在 1 - 5 μg 。
如果有空置的泳道，一定要用等體積的 1x Loading Buffer 補齊，這一小小的舉動卻有著重要作用。它能平衡電場，防止電場不均勻導致最后的一兩個樣品條帶上揚，就像給天平的兩端放上相同重量的砝碼，讓天平保持平衡。
在電泳過程中，也可能會遇到一些問題。比如，電壓過高，蛋白質在凝膠中跑得過快，就像賽跑選手速度過快，容易失控，可能會導致條帶變形、分辨率降低；電壓過低，電泳時間過長，不僅浪費時間，還可能會使蛋白質擴散，條帶變寬 。如果出現(xiàn)條帶彎曲或拖尾的情況，可能是凝膠制備不均勻，就像跑道坑洼不平，影響選手的奔跑；也可能是緩沖液離子強度不對，需要重新檢查緩沖液的配方并新鮮配制。
轉膜：蛋白轉移的精細操作
轉膜是 Western Blot 實驗中不可或缺的關鍵步驟，它肩負著將在凝膠中分離的蛋白質精準轉移到固相膜上的重任，為后續(xù)的抗體檢測搭建起關鍵的橋梁。轉膜的原理基于蛋白質的帶電特性，在電場的強大驅動下，帶負電荷的蛋白質從凝膠有序地遷移至膜上 。這一過程就像是一場精心策劃的搬遷行動，讓蛋白質從凝膠這個 “臨時住所” 順利轉移到膜這個 “新家”，并且在轉移過程中，蛋白質能夠保持其在凝膠中的相對位置和分辨率，為后續(xù)的抗體識別和檢測奠定堅實基礎。
在轉膜方法的選擇上，主要有濕轉、快速濕轉和半干轉這幾種主流方式。常規(guī)濕轉，如同一場在 “水世界” 里的轉移之旅，通過制作 “海綿墊 - 濾紙 - 膜 - 凝膠 - 濾紙 - 海綿墊” 這樣的三明治夾板結構，放入充滿轉膜緩沖液的轉膜槽中，在電場力的強力作用下，蛋白質從凝膠緩緩轉移到膜上 。它的優(yōu)點十分顯著，轉膜效果極為完全，就像搬家時所有物品都能被妥善安置，因此應用廣泛，是眾多科研人員的常用之選。然而，常規(guī)濕轉也存在一些小缺點，所需時間較長，就像一場漫長的搬家過程，可能會耗費較多的時間和耐心。而快速濕轉能在一定程度上解決時間長的問題，比如中科通儀就有相關的快速濕轉設備，能夠滿足一些對時間有更高要求的實驗場景 。半干轉則與濕轉有所不同，它在固定膠 / 膜疊層及施加電場的儀器上另辟蹊徑。其優(yōu)點是轉膜速度較快，能夠在較短的時間內完成蛋白質的轉移，就像一場高效的快速搬家。但它也有不足之處，對于某些蛋白質的轉膜效率可能略低于濕轉，在轉移過程中可能會出現(xiàn)一些小狀況，導致部分蛋白質的轉移效果不夠理想。
在轉膜過程中，有諸多注意事項需要我們格外關注。膜的選擇至關重要，Western Blot 實驗中常用的轉印膜主要有 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯膜）和 NC 膜（硝酸纖維素膜） 。PVDF 膜機械強度高，化學相容性好，靈敏度高，分辨率和蛋白親和力都很出色，尤其適合分子量較小的蛋白質檢測，就像一把精準的 “小蛋白探測器”。不過，它通常需要用甲醇 / 乙醇預先活化，在使用前需要多一道準備工序。NC 膜則背景低，可結合蛋白質和核酸進行各種印跡應用，是一種較為經(jīng)濟實用的選擇 。但它對于分子量較小的蛋白質在洗滌時容易丟失，且韌性較差，操作時需要格外小心，否則容易破碎。在選擇膜時，還需要考慮膜的孔徑大小。通常，Western Blot 轉印膜有 0.2μm 和 0.45μm 兩種孔徑 。0.2μm 的膜如同一張細密的濾網(wǎng)，更適合小于 20kD 的蛋白或低豐度蛋白的檢測；而 0.45μm 的膜則像是一張普通的濾網(wǎng)，更常用，適合大于 20kD 的蛋白。
在操作過程中，要小心避免氣泡的產(chǎn)生。氣泡就像隱藏在轉膜過程中的 “小搗蛋”，會阻礙蛋白質的正常轉移，導致轉膜不均勻，出現(xiàn)條帶缺失或變形等問題。我們可以在組裝轉膜三明治結構時，用玻璃棒輕輕滾動，將氣泡趕出，確保蛋白質能夠順利轉移。
溫度的控制也不容忽視。轉膜過程中會產(chǎn)生熱量，如果溫度過高，就像給蛋白質 “蒸桑拿”，可能會導致蛋白質變性，影響后續(xù)的檢測結果。我們可以使用冰袋或凝膠狀冷卻包來提供有效的降溫，讓蛋白質在一個舒適的 “溫度環(huán)境” 中完成轉移。
電極方向的正確性也至關重要。如果電極方向接反，就像指南針指錯了方向，蛋白質不僅無法順利轉移，還可能會反向遷移，導致實驗失敗。所以在轉膜前，一定要仔細檢查電極方向，確保萬無一失。
免疫檢測：精準識別目標蛋白
免疫檢測是 Western Blot 實驗的關鍵環(huán)節(jié)，它就像一場精準的 “蛋白質識別游戲”，利用抗原抗體特異性結合的原理，從眾多蛋白質中精準地找出目標蛋白。這一過程就像是在茫茫人海中尋找特定的某個人，而抗體就是那把獨一無二的 “鑰匙”，能夠準確地開啟目標蛋白這把 “鎖” 。
在免疫檢測過程中，封閉是重要的第一步。封閉的目的是用無關蛋白填充膜上的空白位點，防止抗體非特異性結合，就像用填充物填滿房間的空隙，讓抗體只能與目標蛋白結合 。常見的封閉液有 5% 脫脂奶粉和 3% BSA（牛血清白蛋白）。對于一般的蛋白質檢測，5% 脫脂奶粉是經(jīng)濟實惠的選擇；而在檢測磷酸化蛋白時，由于奶粉中含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），可能會導致背景信號過高，所以更推薦使用 3% BSA 作為封閉液 。
抗體孵育是免疫檢測的核心步驟。一抗是與目標蛋白特異性結合的抗體，它的濃度和孵育時間對實驗結果有著至關重要的影響?？贵w濃度過高，就像在房間里放了太多的人，可能會導致非特異性結合增加，背景信號增強；抗體濃度過低，則可能會使目標蛋白無法被充分識別，信號變弱 。孵育時間也需要根據(jù)實際情況進行調整，一般來說，室溫孵育 1 - 2 小時或者 4℃過夜孵育都是常見的選擇。4℃過夜孵育雖然時間較長，但可以讓抗體與目標蛋白充分結合，提高檢測的靈敏度 。二抗是與一抗結合的抗體，它通常帶有標記物，如辣根過氧化物酶（HRP）或熒光素，用于后續(xù)的信號檢測。二抗的選擇要與一抗的來源物種相匹配，比如一抗是小鼠來源的，二抗就應該選擇抗小鼠的抗體 。
洗膜是免疫檢測過程中不可或缺的步驟，它的作用是去除未結合的抗體和雜質，確保檢測結果的準確性。洗膜時要使用合適的洗膜液，如 TBST（Tris 緩沖鹽溶液加 Tween - 20）或 PBST（磷酸鹽緩沖鹽溶液加 Tween - 20） 。Tween - 20 是一種非離子表面活性劑，能夠降低表面張力，幫助去除非特異性結合的抗體 。洗膜次數(shù)一般為 3 - 5 次，每次 5 - 10 分鐘。洗膜不充分，就像衣服沒洗干凈，會殘留未結合的抗體，導致背景信號過高；洗膜過度，則可能會洗去部分與目標蛋白結合的抗體，使信號減弱 。在洗膜過程中，要注意輕輕晃動容器，讓洗膜液充分接觸膜的表面，確保洗膜效果均勻一致。
總結
Western Blot 實驗全流程涵蓋了樣本制備、凝膠制備、電泳、轉膜以及免疫檢測等多個關鍵步驟，每一個步驟都如同精密儀器中的一個部件，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)偏差，都可能影響整個實驗的結果。從樣本制備時對裂解液的謹慎選擇，到凝膠制備中對濃度、聚合時間的嚴格把控；從電泳時對蛋白上樣量和電壓的精準調控，到轉膜時對膜的類型、孔徑以及轉膜條件的細致考量；再到免疫檢測中對封閉液、抗體孵育和洗膜的精心操作，每一處細節(jié)都承載著實驗成功的希望。
在實際操作中，大家要充分理解每個步驟的原理和要點，嚴格按照規(guī)范進行操作，并且不斷積累經(jīng)驗，根據(jù)不同的實驗目的和樣本特點，靈活調整實驗條件。只有這樣，我們才能在這個充滿挑戰(zhàn)的實驗過程中，獲得準確、可靠的實驗結果。希望大家在今后的科研道路上，通過不斷地探索和實踐，能夠熟練掌握 Western Blot 實驗技術，為科研工作的順利開展奠定堅實的基礎，在蛋白質研究的領域中收獲更多的成果。
