NGS配套方案
來源：本站 作者：admin 時間：2019/1/15
NGS配套方案
前言
高通量測序技術(shù)（又稱二代測序技術(shù)）是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，有些文獻中稱其為下一代測序技術(shù)（next generation sequencing）。高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(Deep sequencing)。目前高通量測序平臺的代表是Illumina、ABI。
二代測序經(jīng)典路線大致如下： 得到初始樣本（Retsch冷凍研磨樣本制備系統(tǒng)+耶拿C16核酸抽提系統(tǒng)）→初始樣本質(zhì)控與定量（NanoDrop One超微量分光光度計或Bio-Tek Epoch分光光度計+Qubit 3.0）→初始樣本片段化（Covaris M220或Bioruptor）→ Fragment Clean up、加接頭或建庫過程中的液體處理（Caliper自動化工作站：Zephyr或Sciclone NGS）→特定大小片段回收、去除接頭（Blue Pippin）→文庫質(zhì)控及 定量（Qsep1）→PCR擴增（耶拿TAdvanced SG PCR儀）→測序及生物信息學組裝/分析（Partek Genomics Suite）
具體方案如下：
一、 樣本處理
冷凍混合研磨儀MM400
冷凍混合研磨儀MM400的研磨罐在水平方向上進行圓弧式徑向振動。罐內(nèi)的球體由于其慣性作用對位于光滑的研磨罐內(nèi)額壁上的樣品進行帶有高能量的撞擊，并以此粉碎樣品。研磨罐的轉(zhuǎn)動加上研磨球的運動對樣品產(chǎn)生了高強度的混合作用。通過使用多個小球甚至可以進一步的提高混合的效果。當使用很多個小球時（如玻璃球），生物細胞就可以被破碎了。球與球之間的摩擦撞擊作用可以有效導(dǎo)致細胞的破碎。
冷凍混合研磨儀MM400應(yīng)用實例
纖維組織、骨頭、頭發(fā)、化學品、藥丸、藥材、藥片、礦物質(zhì)、金屬礦石、合金、玻璃、陶瓷、土壤、污泥、植物組織、谷物顆粒、油籽料、合成材料、廢料樣品、毛料、塑料、RoHS樣品以及紡織品等。
二、 核酸提取
全自動核酸提取儀InnuPure C16 touch
智能：人性化試劑盒設(shè)計
預(yù)裝封膜試劑條/板，一次可同時提取1-16個樣品。所有試劑盒都是即用型，日常操作非常簡單省時。試劑盒無需分裝，節(jié)省大量分液時間，最大限度減少人工操作。預(yù)裝試劑也避免了人工分裝可能出現(xiàn)的錯加/漏加，加樣過程中因多加而導(dǎo)致的溢液污染。同時試劑盒中包括提取所需的全部試劑/耗材和預(yù)裝試劑，無需您額外購買。
歷史：25年以上的高精度移液經(jīng)驗
可靠性：有效避免交叉污染
獨特優(yōu)勢：移液頭穿孔功能，避免了撕膜帶來的試劑間污染
1ml帶濾芯的槍頭，避免了移液頭和樣品之間的污染
預(yù)裝封膜的試劑，避免了試劑分裝的污染
UV燈滅菌，有效消除批次間樣品的污染
運行時儀器前門完全封閉，阻隔外部環(huán)境污染
三、 DNA質(zhì)控
此款符合人體工程學的獨立式分光光度計具有高分辨率和觸摸屏界面設(shè)計，使您離研究目標更進一步。 強大的自動調(diào) 節(jié)光程技術(shù)有助于準確測量濃縮樣品而無需稀釋。
Acclaro 樣品智能技術(shù)
Acclaro 技術(shù)可以在提供準確的定量測定的同時，增強用戶對樣品質(zhì)量的了解。 對污染物的早期鑒別能夠避免下游應(yīng)用的失敗，從而節(jié)省故障排除的時間。
在數(shù)秒內(nèi)驗證樣品結(jié)果 - 鑒別樣品污染物并獲得矯正的濃度結(jié)果。
通過警報獲取信息 – 通過提供相應(yīng)的技術(shù)支持和解決問題向?qū)?，從而獲得樣品質(zhì)量的即時反饋。
依靠準確結(jié)果——采用嵌入式傳感器和數(shù)字影像分析技術(shù)，確保測量完整性。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 特點
同時包含基座和比色皿檢測模塊，以擴展實驗靈活性和擴大動態(tài)范圍。
測量稀釋樣品，執(zhí)行動力學實驗并獲取細菌培養(yǎng)物的光密度測量結(jié)果。
比色皿檢測模塊包括溫度控制和攪拌區(qū)域。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 增強功能
符合人體工程學的獨立式設(shè)計 – 集成 Android? 平板而無需單獨的計算機，能夠通過無線網(wǎng)絡(luò)*、以太網(wǎng)或 USB 實現(xiàn)數(shù)據(jù)的無縫傳輸。
自動測量與自動調(diào)零功能 –降下檢測臂即可實現(xiàn)即時測量，以此簡化多樣品處理流程。 僅需觸摸一下屏幕，即可實現(xiàn)這些功能的“開”或“關(guān)”。
更廣的動態(tài)范圍——采用自動調(diào)節(jié)光程技術(shù)，無需對高濃度樣品（dsDNA 高達 27,500 ug/μL）進行稀釋
集成式學習中心——僅需指尖滑動，即可瀏覽經(jīng)存檔的技術(shù)支持文檔與教學動畫。
四、 DNA定量
Qubit® 熒光定量儀
與傳統(tǒng)紫外分光法不同，Qubit®3.0采用專門的熒光檢測技術(shù)和染料，特異性的區(qū)分出DNA，RNA，降解核酸，游離核苷酸及蛋白質(zhì)，即便在低濃度下也具有極高的靈敏度和準確性。
選擇性——采用熒光染料，特異識別并定量dsDNA， oligos，RNA，microRNA
準確——比傳統(tǒng)紫外分光光度計更加準確
靈敏——最低檢測1uL樣品，準確定量濃度僅為10 pg/uL 的DNA和12.5 ug/mL的蛋白
簡單——易于使用的觸摸屏界面和Android系統(tǒng)，全新的雙核處理器加快計算速度
五、 DNA片段化
Covaris
M220自動聚焦聲波基因組剪切儀
自動聲波聚焦（Adaptive Focused Acoustic?, AFA)技術(shù) ，是將高速發(fā)展的醫(yī)用超聲顯像診斷（低強度聚焦超聲）與體外震波碎石治療（高強度聚焦超聲）的技術(shù)優(yōu)勢結(jié)合起來，并與先進的微處理器及機器控制結(jié)合起來，可以應(yīng)用在多種生命科學研究中。AFA技術(shù)原理實質(zhì)上是一個受控的液體空腔化的動力學過程，簡單可理解為：當聲波通過液體時，產(chǎn)生的微小氣泡迅速膨脹，隨后由于液體迅速返回空穴導(dǎo)致氣泡崩潰，從而產(chǎn)生液流剪切力，Covaris AFA技術(shù)就是通過控制這種氣穴作用來控制剪切力，即成百上千個空化氣泡的累加作用，產(chǎn)生的液流沖擊力>100m/sec，AFA技術(shù)即通過計算機控制和儀器及耗材各部分的精確設(shè)計，從而控制作用在樣本上的剪切力將核酸剪切到目的大小。（如下簡圖）
空氣氣泡 氣泡崩潰產(chǎn)生液流剪切力
二代測序應(yīng)用領(lǐng)域：
還沒有參考序列的物種：在基因組水平上進行重頭測序（de novo sequencing），獲得該物種的參考序列，為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；
有參考序列的物種：進行全基因組重測序（resequencing），在全基因組水平上掃描并檢測突變位點，發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。
轉(zhuǎn)錄組水平：進行全轉(zhuǎn)錄組測序（whole transcriptome resequencing），從而開展可變剪接、編碼序列單核苷酸多態(tài)性（cSNP）等研究；
轉(zhuǎn)錄組水平：與染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技術(shù)相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。
小分子RNA測序（small RNA sequencing）：通過分離特定大小的RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA分子。
二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用--目標序列捕獲測序技術(shù)（Targeted Resequencing）。這項技術(shù)首先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核苷酸探針，這些寡核苷酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補結(jié)合，從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術(shù)對這些區(qū)段進行測序。目前提供序列捕獲的廠家有Agilent和Nimblegen ，應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測序。科學家們目前認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費用較低，更是因為外顯子組測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學表型結(jié)合更為直接。
目前，外顯子組測序開始廣泛應(yīng)用于尋找疾病的候選基因上。
以上領(lǐng)域的測序都需要進行核酸片段化，M220是目前最主要的片段化工具。
六、 PCR擴增
Biometra TAdvanced 96 PCR儀
有鍍金純銀樣品槽、金色合金等多種樣品模塊可選，實現(xiàn)高效傳熱品槽通量靈活，有96孔、60孔、384孔等，模塊可更換精準的溫度控制：通過智能的溫度控制系統(tǒng)RAC實現(xiàn)快速的升降溫變化、優(yōu)異的溫度準確性和均一性，以及高度的重復(fù)性線性溫度梯度工具（LGT）：實現(xiàn)準確的溫度梯度設(shè)置和控制，極大地方便了退火溫度的優(yōu)化（帶溫度梯度的型號）高性能智能熱蓋（HPSL）：深凹的熱蓋設(shè)計可有效地將熱量控制在熱蓋內(nèi)，防蒸發(fā)效果極佳靜音技術(shù)（WQT）：運行時非常安靜，無噪音，提供舒適的工作環(huán)境巧妙的散熱設(shè)計：通過儀器后部和底部進行高效散熱，儀器旁邊可放置其他儀器，節(jié)省實驗室空間儀器自檢功能：可進行自動的檢測診斷，提供各種運行和故障信息
七、 RNA樣本質(zhì)量控制
Bioptic Qsep1生物分析儀
Qsep1生物分析儀是一款便攜式毛細管電泳儀，基于毛細管電泳中待測樣品在電場作用下離子遷移速度不同而對組分進行分離和分析的原理，克服傳統(tǒng)凝膠電泳實驗耗時耗力有污染等弊端而研發(fā)的一款高性能的全自動化毛細管核酸分析儀。它既可用于電泳分離，同時對每一個片段的大小進行精確測定和濃度定量。
Qsep1生物分析儀的操作系統(tǒng)非常簡便，簡化了繁復(fù)的操作與流程，能讓一般用戶在5分鐘內(nèi)學會操作系統(tǒng)，1分鐘分析樣品得出結(jié)果。它將傳統(tǒng)實驗室的多個繁雜步驟：包含樣品準備、配膠、點樣、跑膠、拍照及結(jié)果判讀，整合簡化為單一步驟。使用可拋棄式卡夾，使復(fù)雜的生物樣本分析以快速、精確、低成本的方式得以實現(xiàn)。其高通量、高分辨率、高靈敏度、全自動、標準化、無污染的特點賦予了其強大的檢測分析功能。
Qsep1生物分析儀可代替?zhèn)鹘y(tǒng)凝膠電泳，適用于分子生物學實驗室、教學實驗室、快速檢測中心、戶外檢測等需要快速出結(jié)果、樣本量少的實驗室。
產(chǎn)品特點：
Qsep1生物分析儀，采用可拋棄式的預(yù)制膠卡夾，即插即用，全自動進樣，無須人工制膠、灌膠、上樣，免去了手工制膠的繁瑣和人工上樣的 誤差，可用于核酸質(zhì)控和PCR產(chǎn)物電泳，分辨率高，重復(fù)性好，可處理1-8個任意個數(shù)樣本，真正實現(xiàn)了核酸片段和蛋白的快速、自動化、高通量、高分辨率 分析。
全自動進樣：自動分析1-8個樣本
拋棄式卡夾：無需制膠，灌膠，每支卡夾可分析100-300樣品（DNA,RNA和Protein）
快速分析：可達1分鐘內(nèi)/樣品
高靈敏度：可達pg級
高分辨率：最佳可達1-4bp
結(jié)果呈現(xiàn)：數(shù)字數(shù)據(jù)，凝膠成像圖，毛細管電泳圖
軟件分析：同時進行定性及定量分析，界面友好，操作人性化
樣品需求和消耗：最低樣品需求量1μL，上樣量小于0.1μL
低成本：市場上最經(jīng)濟的儀器和耗材費用
應(yīng)用：
?遺傳分析 ?限制片段長度多態(tài)性分析 (RFLP)
?PCR 產(chǎn)物檢測 ?質(zhì)粒DNA酶切，構(gòu)造及純度分析
?Genomic DNA & NGS 質(zhì)控 ?高分辨率多重PCR分析
?DNA 引物質(zhì)控（Primer QC) ?STR/微衛(wèi)星（SSR）
?總RNA，cRNA，片段化RNA，micro-RNA質(zhì)控 ?合成寡核苷酸片段分析
八、 樣本定量
熒光定量基因擴增儀qTOWER3
來自德國耶拿的全新一代熒光定量基因擴增儀qTOWER3 touch系列，采用獨特的4個高效LED固態(tài)光源作為激發(fā)光源，并通過專利性的光纖掃描系統(tǒng)來采集熒光信號，確保市面上常用的熒光定量PCR染料都能得到出色穩(wěn)定的激發(fā)和檢測。靈活的檢測通道配置，升級方便，最高可實現(xiàn)六重目的基因的同時檢測。耶拿公司具有近三十年的基因擴增儀研發(fā)制造歷史，快速且耐用的鍍金純銀樣品槽使其96孔溫度均一性達到± 0.15 ℃。選配的12列線性溫度梯度功能使用戶能快速確定最佳的PCR退火溫度進而優(yōu)化反應(yīng)條件，是用戶優(yōu)化PCR程序的得力助手。用戶可以選擇用電腦來操控儀器，也可以選擇用彩色觸摸屏來操控儀器。它具有開放的試劑和耗材系統(tǒng)，適用于標準的96孔PCR板、8聯(lián)管或者PCR單管。
快速反應(yīng)：
鍍金純銀樣品槽，最大升溫速率為8℃/s，熱導(dǎo)性好，且耐腐蝕抗氧化
精準控溫：
溫度準確性為±0.1 ℃，96孔的溫度均一性為±0.15 ℃，精準的溫度控制帶來穩(wěn)定且特異性好的擴增效果
線性溫度梯度：
獨特的12列線性溫度梯度功能，能幫助用戶快速找到最精準的退火溫度
自動熱蓋：
采用先進的自動熱蓋技術(shù)，儀器自動控制熱蓋的壓力，確保有效的防蒸發(fā)效果
耗材開放：
對耗材沒有特殊要求，用戶可自由選擇96孔板、8聯(lián)管或單管，使用方便
高強度寬光譜的激發(fā)光源：
采用藍色、綠色、紅色、白色（RGBW）四個高強度長壽命LED固態(tài)光源，確保在整個光譜檢測范圍內(nèi)都有很強的光強，提高檢測靈敏度，而且不發(fā)熱，使用壽命長，終身免維護
高靈敏度檢測器：
最新型的通道式光電倍增管檢測器，檢測靈敏度更高
快速掃描檢測：
8道光纖掃描檢測快速，即使完成六通道的96孔掃描，也只需要6s
無需光路校正：
掃描檢測能確保每孔的信號激發(fā)和檢測光程都完全一致，無需光路校正，因此無需額外占用一個校正通道，可實現(xiàn)真正的六通道基因檢測
檢測通道配置靈活：
用戶可根據(jù)需求靈活選擇通道數(shù)和各通道的檢測濾光片組, 有12種不同波長的濾光片組可選擇以配置成1-6通道的檢測系統(tǒng)，包括濾光片錯配的FRET檢測組合和專用于蛋白熔解曲線分析的濾光片組，覆蓋從藍光到紅光的全光譜，通道數(shù)可以隨時方便升級，以滿足未來更多的檢測需求
九、 片段回收
Blue Pippin全自動核酸片段回收系統(tǒng)
Blue Pippin
回收的片段范圍：50bp－50kp
樣品通量：1－5個樣品
回收效率：50－80％
創(chuàng)新的技術(shù)
Pippin Prep系統(tǒng)包括一次性的5泳道預(yù)制膠電泳槽，一個帶有DNA熒光檢測光路單元(非紫外)的電泳平臺。
運行中，軟件通過實時光路檢測，和參考泳道中的DNA ladder進行比對，確定已經(jīng)設(shè)置回收長度范圍的DNA片段到達洗提泳道(elution channel)的準確時間
通過電極切換，打開洗提泳道，使目標片段進入洗提通道的回收室中，從而實現(xiàn)回收。然后電極再次切換，洗提泳道關(guān)閉，剩余的DNA分子進入原先的分離泳道(separation channel)。
自動化核酸片段回收 VS傳統(tǒng)切膠回收
手工切膠回收Pippin Prep/Blue Pippin 幾個小時的手工操作 幾分鐘的手工操作 回收的核酸片段大小不精確 精確回收指定大小范圍的核酸片段 存在小分子量（LMW）污染 去除小分子量（LMW）污染 30-50％的回收效率 50-80％的回收效率 回收中、小核酸片段 可以回收大的核酸片段
應(yīng)用范圍
下一代測序，亞克隆，轉(zhuǎn)基因等等
小分子量或者大分子量的核酸片段回收
大小很近的核酸片段的區(qū)分回收
珍貴的微量樣品中的核酸片段回收
